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一、细胞培养
    人结肠癌细胞系CaCo2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116、LoVo均购自ATCC,并由上海消化外科研究所传代保存。LoVo采用含10%胎牛血清的F-12K培养传代;CaCo2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116均使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,置于37℃、5%CO2的培养箱中,以1∶2至1∶4的比例传代培养。
    二、方法
    1.样本收集及免疫组化染色:结肠直肠肿瘤标本取自上海市微创外科临床医学中心手术室。手术标本切除后生理盐水清洗,打开肠腔,剔除瘤体表面坏死及炎性肉芽组织;取肿瘤中心部位及距肿瘤5cm以上的正常肠黏膜全层组织,切成1cm块状后置入样本管。组织标本经4%甲醛溶液充分固定后,制作蜡块,切片、贴片。随后采用链霉素亲和素-过氧化酶复合物(SP)法进行免疫组化染色,DAB显色。TMPRSS4多克隆抗体购自美国Proteintech公司,1∶50稀释。
    2.半定量RT-PCR:采用Trizol试剂(Invitrogen,美国)提取细胞总RNA。电泳鉴定RNA完整性,分光光度计260nm处测定RNA浓度,使用逆转录试剂盒(Takara,日本)在ABIPrismSDS7000中进行逆转录cDNA合成。上海吉玛生物有限公司合成如下引物:TMPRSS4上游引物5′-TCCAAGGACCGATCCACACT-3′,下游引物5′-AAGTTGTCGAAACAGGCAGAG-3′;GAPDH上游引物5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAA-3′,下游引物5′-TGTCATACCAGGAAATGAGC-3′。cDNA在PCR仪(AppliedBiosystems,美国)中进行反应,50℃2min、95℃10min、95℃15s、60℃30s、72℃30s,共35个循环;然后,72℃10min,扩增产物于1%琼脂糖凝胶中,130V、30min条件下电泳并在紫外灯下摄片,成像保存。

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